PCR

Amplificación del ADN: la PCR

La amplificación del ADN mediante PCR no podía faltar en este blog. Ya he podido comentar como se trabaja con el material hereditario anteriormente. Mejor dicho, cómo se prepara para poder sacarle partido. Para poder tener varias copias de una región específica de ADN, se utiliza la tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction = PCR).

Comienzos de la PCR

Este “gran invento” de la PCR se lo debemos al premiado Nobel en Química de 1993 Kary B. Mullis. Se le ocurrió realizar in vitro las condiciones necesarias para conseguir copias de fragmentos de ADN.

El ADN está en forma de doble hélice. Para que se pueda amplificar cada hebra, es necesario que se rompan los enlaces existentes para que se mantenga esa estructura. La idea consiste en reproducir ese vaivén molecular en un tubo de ensayo. Y así pudo hacerlo con la ayuda de todos los compañeros de la empresa en la que Kary B. Mullis trabajaba: Cetus Corporation.

Según nos puede contar la historia cercana de la Biología Molecular, el señor Mullis tuvo la brillante idea mientras conducía por las carreteras californianas a horas nocturnas. Observó el ir y venir de los coches cruzándose por las diferentes vías. De pronto, paró el coche y comenzó a pensar sobre el proceso de amplificación del ADN in vitro y como con tan sólo 20 ciclos podrían obtenerse la friolera de un millón de moléculas a partir de dos hebras de dicho ácido desoxirribonucleico.

Cuando volvió al trabajo lo puso en práctica. Funcionaba. La sencillez de todo el proceso hizo que hubiera muchos desconfiados dentro del ámbito de la Genética molecular. Poco tiempo después, otro premio nobel llamado Joshua Lederberg se quedó perplejo mirando el póster explicativo de Mullis con todo el proceso detallado. Le preguntó “¿funciona?”, a lo que después espetó un “¿Por qué no se me habría ocurrido a mí?”.

Amplificación del ADN paso a paso

Este proceso se realiza elevando la temperatura aproximadamente a 95 ºC durante un breve período de tiempo. Se denomina desnaturalización.

Posteriormente se necesita que los cebadores (oligonúcleótidos o secuencias cortas de ADN de unos 20 nucleótidos diseñadas para que flanqueen una zona específica de ADN que se quiera amplificar) se anclen a sus secuencias complementarias. L

a temperatura juega un papel importantísimo, puesto que cada pareja de cebadores (siempre se habla de parejas puesto que se debe tener un primer o cebador por un lado y otro por el otro para que se amplifique el mismo fragmento por ambos lados y producir la amplificación de la zona flanqueada) hibrida (se une al ADN) a una temperatura que, generalmente, puede variar entre 45 y 65 ºC. Aunque hay protocolos en los que se utilizan variaciones de temperatura para obtener un mejor rendimiento, pero esto lo comentaré en artículos posteriores.

Finalmente, se necesita una extensión de los fragmentos flanqueados por los primers gracias a la acción de una molécula llamada Polimerasa y que tiene su temperatura óptima de reacción a 72 ºC (aunque se utiliza también una temperatura óptima de 68 ºC, dependiendo de la casa que suministre la polimerasa).

Resumen de la PCR

Por lo tanto y en resumen se tiene en todo el proceso 3 fases:

Desnaturalización.
Hibridación de los cebadores.
Extensión de los fragmentos. Al final de todo el programa, se introduce una fase de extensión más larga para que se termine de obtener un mayor número de copias.

Todo este proceso se realiza en los termocicladores: las reacciones se preparan en frío y los tubos o placas de reacción se depositan en estos aparatos que son programados para realizar los ciclos que he explicado antes. Un esquema de programa es el que pongo en la imagen siguiente:

En cada ciclo de amplificación del ADN, el fragmento diana aumentará en el número de copias de forma exponencial. Esto provoca que, al final de un programa básico, se obtengan aproximadamente hasta 100 millones de copias del fragmento deseado.

Consideraciones sobre la amplificación del ADN por PCR

Las variaciones de tiempo dependen principalmente de la longitud de los fragmentos. Cuanto más tiempo mayor es el fragmento a amplificar. La clave de una buena eficiencia depende de los diseños de las reacciones de PCR que se deben ajustar a las condiciones de cada reacción.

Al principio, las polimerasas que se utilizaban no eran termorresitentes. Esto provocaba que, en cada ciclo, había que añadir polimerasa para que se pudiera extender la amplificación del ADN. Ahora se utilizan polimerasas que permiten ser añadidas en la preparación de las reacciones y se puede olvidar de ello.

No más importante, cuidado con el material a ser utilizado: el calibrado de las micropipetas es esencial y la “limpieza” del resto de materiales y lugar de trabajo pueden ser clave.

Me gustaría explicarlo todo: como se diseñan los cebadores, la realización de la reacción de PCR y todos los componentes, los estudios que se pueden derivar…etc, pero igual no acabo con el artículo y creo que la base sí que la he plasmado.

Una cosa es clara: sin la propia evolución en los conocimientos sobre el ADN y su comportamiento no se podría haber llegado a la situación de Mullis. Personas como James D. Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin, Arthur Kornberg, H. Gobind Khorana o Thomas D. Brock tienen en sus espaldas haber sembrado poco a poco la información que ayudó a Kary B. Mullis a desarrollar su idea (que puede tener cierta controversia con el trabajo presentado por Kjell Kleppe).

Información adicional sobre la amplificación del ADN por PCR

Lo mejor es partir del propio escrito original de Kary B. Mullis. Después de generar las correspondientes patentes se puede encontrar por la red un par de documentos datados en 1986 y 1987 respectivamente con los títulos “Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction” y “Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction”.

Otra lectura que recomiendo encarecidamente es mi monográfico dedicado a la PCR que escribí en su momento para Journal of Feelsynapsis. Como la revista se ha reconvertido en Principia, cualquiera que desee leerlo puede pedirme una copia que se la enviaré con honores.

Este vídeo explica todo bastante bien con un inglés muy fácil de seguir. Incluso se observan los fragmentos que no son específicos (que no se buscan amplificar pero que se obtienen de todas formas por la hibridación de los primers)
[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_KsDI[/youtube] Referencia del vídeo: Essential Cell Biology, 3rd Edition. Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, & Walter

Si se tuviera alguna duda al respecto, los comentarios e email están a disposición de cualquiera (y abiertos las 24 horas del día los 365 días del año).

Escuchando: el sonido de las campanas de Papá Noël…JOJOJO!!

Los termocicladores

No son más que aparatos que pueden ser programados para generar ciclos de temperatura a nuestro antojo. De esta forma podremos diseñar programas específicos para poder amplificar fragmentos de ADN determinados. Simplemente son aparatos que contienen una termoplaca, donde se colocan las muestras, y que es controlada mediante un software informático.

Sin embargo, el uso de los termocicladores también es útil no sólo en procesos de PCR. Su utilidad es igual de buena en estudios con enzimas de restricción que necesitan actuar a ciertas temperaturas un determinado período de tiempo. De esta forma se controlan perfectamente las condiciones en las que sucede la reacción.

AmplifX

Estamos ante un programa muy básico que permite simular PCRs y así permite verificar que los primers diseñados para amplificar una secuencia específica, están bien construidos. Esta aplicación permite guardar los primers a modo de base de datos. Así se pueden tener varias parejas de cebadores guardadas y probar con varios fragmentos de ADN secuenciados para probar la reacción de amplificación.

Tiene una funcionalidad añadida: informa sobre la teórica temperatura de anillamiento óptima para llevar a cabo la amplificación de forma específica. Sin embargo es mejor seguir con las indicaciones habituales que seguir esta recomendación (lo he podido comprobar en amplificaciones específicas). Así también, al añadir la pareja de cebadores, muestra un diálogo que comenta la temperatura de fusión, porcentaje de c+g o la estabilidad del extremo 3’ entre otros parámetros.
Es otra herramienta que puede facilitar algo el trabajo del laboratorio.

Enlace AmplifX

Lo maravilloso de las micropipetas

El ajuar de laboratorio es siempre escaso. Y el cansancio que conlleva intentar mejorar esas condiciones es proporcional al material disponible: cuanto más y mejor material se tiene, menos cansancio se acumula. Esto que parece una bobada, cuando se trata de estar haciendo reacciones de PCR durante toda una semana para poder mapear genes…pues deja de ser un simple pipeteo a convertirse en un destroza hombros, antebrazos y pulgares. Y, si además para ver mejor el alicuoteo para cada muestra, el proceso se debe hacer de pie…pues hay que añadir cansancio en las piernas y la espalda. Vamos, que acabas el día como si hubieras trabajado en la obra, con el agotamiento mental añadido de estar concentrado para no pifiarla a la hora de pipetear. Para los que no se hacen una idea: una tanda de PCR normal que realizo yo en el laboratorio consiste en 105 muestras en las que, en cada una de ellas, hay que añadir un volumen determinado de dNTPs, buffer de reacción para la polimerasa, Taq polimerasa, Agua estéril Mili Q y el DNA correspondiente. Todo el mundo científico se vale de la maravillosa ayuda de las casas comerciales que permiten no tener que hacer a mano los búfferes de reacción. Y los dNTPs junto con el búffer y el agua se puede juntar para hacer un mix. Incluso si tienes unos cebadores que vayan bien, puedes incluirlos en el mix. Pero, cuando se trata de mapear genes y tienes que hacer la reacción para cada uno de los 105 individuos para ese gen determinado, pues, al menos, necesitas pipetear…unas 210 veces si haces el mix con primers incluidos y no tienes una micropipeta. A eso hay que añadir los pipeteos de la preparación de los mix de reacción. Todo esto lleva un gasto de tiempo bastante grande. Pero, si se quiere estar seguro de que vaya una concentración determinada de cada pareja de cebadores en cada muestra, pues el número de pipeteos se duplica. Todo esto lo cuento para un científico que no tiene la posibilidad de tener una micropipeta multicanal.
A eso quería yo llegar. Para los que no lo sepan, una pipeta multicanal es, como su nombre indica, una micropipeta que tiene muchos canales. Dependiendo del modelo, las hay de 8 ó 12 canales. Por lo tanto, cada vez que accionamos el émbolo para dejar soltar la alícuota pertinente en una batería de muestras, haremos el mismo trabajo reducido en una octava parte como poco. Vamos, que se puede hacer lo mismo que con la micropipeta normal pero 8 veces más rápido (si tiene ocho canales) ó 12 veces más rápido, como es el caso de la micropipeta que dispongo.
A eso de la reducción de esfuerzo hay que añadir una reducción de error de pipeteo, ya que cada vez que se acciona el mecanismo la succión y vertido es el mismo en los 12 pocillos a la vez.
Pero hay algo más. El cansancio mental también se reduce puesto que no se tiene que estar tan concentrado (esto no significa que no haya que estarlo para que todo vaya bien, eh!) a la hora de controlar los pipeteos.
Si a esto sumamos la pericia de cada investigador a la hora de hacer mixes, la reducción del número de pipeteos se reduce hasta un número de…¡¡36 pipeteos por cada tanda de 105 reacciones!!.
Todo esto también tiene un fallo: la captura de cada punta con las micropipetas multicanal. Cada casa comercial que fabrique este tipo de pipetas, produce unas puntas específicas que permite un mejor anclaje de éstas. Sin embargo, en la gran mayoría de los laboratorios se piden puntas a granel para todas la pipetas y pedir un cargamento a mayores de esas puntas tan específicas conlleva un gasto bastante grande. Siempre que se usan puntas no especiales, se suele tener que apretar un poco cada punta para que tome el volumen correcto. Esto hay que hacerlo con cuidado para preservar las condiciones de esterilidad. Pero cuando ya lo has hecho unas cuantas veces, la maña bate por goleada a la falta de presupuesto.
En fin, que todo laboratorio que tenga que manejar un número considerable de muestras, debería tener unas cuantas micropipetas multicanal. Tan sólo un consejo más: cada pipeta debería ser personal en intransferible. Para evitar continuas descalibraciones.

Escuchando: El golpeo a las teclas del portátil