ADN

Mutación relacionada con el síndrome de Tourette

El estudio se publicó on line el 5 de mayo en el New England Journal of Medicine por un equipo dirigido por Matthew State, profesor en la Universidad de Yale Child Study Center y en los Departamentos de Psiquiatría y Genética, y co-director del Programa de Yale sobre Neurogenética.
El síndrome de Tourette (ST) es un trastorno neurológico relativamente común que se caracteriza por movimientos involuntarios, tics rápidos y súbitos o vocalizaciones que se producen repetidamente en la misma forma. Afecta a uno de cada 100 niños en edad escolar. Los tics pueden comenzar a mediados de la niñez y, el pico, al inicio de la adolescencia. El ST no es potencialmente mortal, pero puede ser discapacitante. Los niños y adultos afectados suelen tener otros trastornos neuropsiquiátricos como el trastorno obsesivo-compulsivo o depresión.
Sobre la base de pruebas sólidas de que los genes contribuyen al ST, el laboratorio del profesor State ha buscado mutaciones genéticas raras que causan ST durante más de una década, con la esperanza de lograr una mejor comprensión de la causa del trastorno y generar oportunidades de investigación a desarrollar tratamientos más eficaces .
State y su equipo encontraron una familia con el ST, con una rara mutación en un gen llamado 1-histidina descarboxilasa (HDC). Este gen produce una proteína que se requiere para la producción de histamina. La histamina se conoce más a menudo por su papel en la respuesta alérgica, pero es un importante neurotransmisor que influye en una variedad de funciones cerebrales.
El padre y toda la descendencia fueron diagnosticadas con el ST. La madre y su familia no tienen el trastorno. Dos niños y el padre también han experimentado el trastorno obsesivo-compulsivo. El laboratorio de State tomó muestras de ADN de todos los miembros de la familia. El estudio se centró en la región uno del genoma que comparten todos los individuos afectados, y, después, se identificó una mutación rara en HDC dentro de esta región, que dio lugar a la proteína mutada que da lugar a la pérdida de su función.
State dijo que el trabajo realizado sobre la histamina cerebral por otros laboratorios muestra que los ratones con niveles bajos son más propensos a comportamientos repetitivos que son similares a los tics humanos y que, incrementando la histamina cerebral, el problema puede invertirse.

Estructuras proteínicas de las variantes del síndrome de Tourette — Imagen en la que se muestra la mutación del gen HDC

Estos avances en la genética sirven ya de un soporte que antes no se tenía. Los medicamentos que se utilizan para tratar este síndrome de Tourette se basan en suministrar histamina. Ahora se sabe el inicio genético de esta terapia. Espero que os haya gustado.

Referencia: L-Histidyne Decarboxylase and Tourette’s Syndrome

El estrés y el ADN

Desde el año pasado con los premios Nobel, los telómeros han dado que hablar más allá de la comunidad científica. Los estudios realizados en temas relacionados con estas porciones finales de los cromosomas siempre tienen un factor común: la asociación con los efectos del envejecimiento. Pues bien, se ha podido realizar un estudio muy curioso sobre este tema, pero que tiene que ver con los lagartos y el estrés sufrido ante la cercanía de la muerte. Mats Olsson, de la Universidad de Wollongong, en Nueva Gales del Sur, Australia, y sus colegas midieron los telómeros de los lagartos de arena silvestres, Lacerta agilis. Encontraron que la longitud del telómero se vio afectado en los animales cuya cola se había desprendido para escapar de los ataques de los depredadores especialmente en varones. Los lagartos que habían sido atacados hacía poco tiempo eran más propensos a tener telómeros más cortos, y este efecto fue mayor en los machos grandes que en los pequeños y en las hembras más grandes y que en los varones y las hembras más pequeñas. Los machos más grandes tienen una vida más estresante que los pequeños ya que su capacidad reproductiva es mayor (es que el ligar estresa también a los lagartos XDD) y son más atacados por los depredadores. También tienen niveles más altos de corticoides que los lagartos pequeños. atacados por los depredadores. La pérdida de la cola, reduce las posibilidades de supervivencia futura puesto que la cola ya no es la misma que la original: no contiene los huesos, sólo cartílagos, por lo que no se puede “quitar” de nuevo. La pérdida de la cola también provoca un cambio en el comportamiento, adoptando un estilo de vida menos activo. Así que lo mejor es no estresarse y tomarse la vida con más tranquilidad. Por lo menos si eres lagarto.

Referencias: Biology letters

La replicación del ADN

La explicación de la replicación del ADN sería muy laboriosa y dura de seguir para los no “vocacionales” en el tema. He indagado un poco por esta autopista de la información y he encontrado un vídeo y unas imágenes valen más que mil palabras. Además, hace una breve introducción sobre el descubrimiento de la estructura del ADN que me gusta.
Gran parte de la traducción es automática, como sucedía en el artículo del Gran colisionador de hadrones. Robotizada. Pero los vídeos que muestran la actuación de la ADN polimerasa son geniales. Incluso lo presenta un tal Doctor Asso, que en EE.UU. no tendría mucha gracia pero en España…jeje. La pena es que no sea biólogo, pero en USA los buenos genetistas suelen ser médicos. Disfrutad el vídeo.
[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=n7wtjTFLi9g[/youtube]

Las enzimas de restricción

A lo largo de estas semanas estoy volviendo a trabajar con enzimas de restricción y, antes de publicar un artículo sobre ciertas aplicaciones, será buena idea explicar un poco sobre el tema.
Las enzimas (ó endonucleasas) de restricción son unas proteínas con acción catalítica que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos cuatro ó seis pares de bases en el ADN de doble hebra, y cortar en todos los puntos donde se encuentre dicha secuencia. Este lugar de corte se denomina diana de restricción. Cada enzima de restricción tiene una diana particular en el ADN. En la actualidad hay un amplísimo catálogo de enzimas de restricción (podéis ver un ejemplo en el listado de Takara) y los usos destinados son varios: para la realización de mapas físicos (hablamos de ADN, no de cordilleras XDD), huella genética ó fingerprinting, búsqueda de polimorfismos tipo SNPs, AFLPs, RFPLs, utilización en pasos previos a la clonación…etc. Y multitud de aplicaciones más específicas que hacen muy versátiles en su uso.
Con un ejemplo queda todo más claro: una enzima muy típica es Alu I que reconoce la secuencia AGTC y corta la doble hélice del ADN entre la Guanina y la Timina. Su actuación sería darse un paseo por toda la hebra de ADN en búsqueda de esa diana. En el momento que la encuentra, se ancla y corta, obteniéndose dos fragmentos. Si no hubiera esa secuencia diana, no corta y el fragmento de ADN de doble cadena que teníamos quedará igual que antes. Si os dais cuenta, es un buen método para diferenciar individuos. La variación de nucleótidos entre distintos individuos puede observarse de esta forma sin necesidad de secuenciar.
No se aplican estas enzimas a la totalidad del ADN genómico, ya que se obtendrían multitud de bandas que no se podrían distinguir bien. Se amplifican, mediante PCR, ciertos lugares específicos del ADN para que las dianas de restricción permitan obtener unos resultados claros para su posterior análisis.
Para los que trabajamos en un laboratorio esto que acabo de explicar es como usar el cuchillo en las comidas, pero ya he visto que hay cierto interés en ciertas aplicaciones de uso en el laboratorio y pronto haré una review de herramientas que facilitan el estudio mediante enzimas de restricción.
Por ahora, para que no sea un rollo lo que he explicado, os dejo con un vídeo (es una animación en 3D) sobre como actúa una enzima de restricción para clonar un fragmento de ADN. Recordad lo que es la clonación. Es una de las técnicas de ingeniería genética más comunes en los laboratorios de biología molecular. Se puede ver como la actuación de la enzima proporciona unos extremos en el plásmido (son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula) que son complementarios al corte hecho a un fragmento de ADN que queremos insertar con la misma enzima de restricción. Por último serán unidos los extremos por otra enzima llamada ligasa. Así se puede incluir como si formara parte del plásmido y obtener copias idénticas del fragmento de interés al replicarse la bacteria.
[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=yDGA8n1oJ5Q[/youtube] Espero que os haya gustado.

Amplificación del ADN: la PCR

La amplificación del ADN mediante PCR no podía faltar en este blog. Ya he podido comentar como se trabaja con el material hereditario anteriormente. Mejor dicho, cómo se prepara para poder sacarle partido. Para poder tener varias copias de una región específica de ADN, se utiliza la tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction = PCR).

Comienzos de la PCR

Este “gran invento” de la PCR se lo debemos al premiado Nobel en Química de 1993 Kary B. Mullis. Se le ocurrió realizar in vitro las condiciones necesarias para conseguir copias de fragmentos de ADN.

El ADN está en forma de doble hélice. Para que se pueda amplificar cada hebra, es necesario que se rompan los enlaces existentes para que se mantenga esa estructura. La idea consiste en reproducir ese vaivén molecular en un tubo de ensayo. Y así pudo hacerlo con la ayuda de todos los compañeros de la empresa en la que Kary B. Mullis trabajaba: Cetus Corporation.

Según nos puede contar la historia cercana de la Biología Molecular, el señor Mullis tuvo la brillante idea mientras conducía por las carreteras californianas a horas nocturnas. Observó el ir y venir de los coches cruzándose por las diferentes vías. De pronto, paró el coche y comenzó a pensar sobre el proceso de amplificación del ADN in vitro y como con tan sólo 20 ciclos podrían obtenerse la friolera de un millón de moléculas a partir de dos hebras de dicho ácido desoxirribonucleico.

Cuando volvió al trabajo lo puso en práctica. Funcionaba. La sencillez de todo el proceso hizo que hubiera muchos desconfiados dentro del ámbito de la Genética molecular. Poco tiempo después, otro premio nobel llamado Joshua Lederberg se quedó perplejo mirando el póster explicativo de Mullis con todo el proceso detallado. Le preguntó “¿funciona?”, a lo que después espetó un “¿Por qué no se me habría ocurrido a mí?”.

Amplificación del ADN paso a paso

Este proceso se realiza elevando la temperatura aproximadamente a 95 ºC durante un breve período de tiempo. Se denomina desnaturalización.

Posteriormente se necesita que los cebadores (oligonúcleótidos o secuencias cortas de ADN de unos 20 nucleótidos diseñadas para que flanqueen una zona específica de ADN que se quiera amplificar) se anclen a sus secuencias complementarias. L

a temperatura juega un papel importantísimo, puesto que cada pareja de cebadores (siempre se habla de parejas puesto que se debe tener un primer o cebador por un lado y otro por el otro para que se amplifique el mismo fragmento por ambos lados y producir la amplificación de la zona flanqueada) hibrida (se une al ADN) a una temperatura que, generalmente, puede variar entre 45 y 65 ºC. Aunque hay protocolos en los que se utilizan variaciones de temperatura para obtener un mejor rendimiento, pero esto lo comentaré en artículos posteriores.

Finalmente, se necesita una extensión de los fragmentos flanqueados por los primers gracias a la acción de una molécula llamada Polimerasa y que tiene su temperatura óptima de reacción a 72 ºC (aunque se utiliza también una temperatura óptima de 68 ºC, dependiendo de la casa que suministre la polimerasa).

Resumen de la PCR

Por lo tanto y en resumen se tiene en todo el proceso 3 fases:

Desnaturalización.
Hibridación de los cebadores.
Extensión de los fragmentos. Al final de todo el programa, se introduce una fase de extensión más larga para que se termine de obtener un mayor número de copias.

Todo este proceso se realiza en los termocicladores: las reacciones se preparan en frío y los tubos o placas de reacción se depositan en estos aparatos que son programados para realizar los ciclos que he explicado antes. Un esquema de programa es el que pongo en la imagen siguiente:

En cada ciclo de amplificación del ADN, el fragmento diana aumentará en el número de copias de forma exponencial. Esto provoca que, al final de un programa básico, se obtengan aproximadamente hasta 100 millones de copias del fragmento deseado.

Consideraciones sobre la amplificación del ADN por PCR

Las variaciones de tiempo dependen principalmente de la longitud de los fragmentos. Cuanto más tiempo mayor es el fragmento a amplificar. La clave de una buena eficiencia depende de los diseños de las reacciones de PCR que se deben ajustar a las condiciones de cada reacción.

Al principio, las polimerasas que se utilizaban no eran termorresitentes. Esto provocaba que, en cada ciclo, había que añadir polimerasa para que se pudiera extender la amplificación del ADN. Ahora se utilizan polimerasas que permiten ser añadidas en la preparación de las reacciones y se puede olvidar de ello.

No más importante, cuidado con el material a ser utilizado: el calibrado de las micropipetas es esencial y la “limpieza” del resto de materiales y lugar de trabajo pueden ser clave.

Me gustaría explicarlo todo: como se diseñan los cebadores, la realización de la reacción de PCR y todos los componentes, los estudios que se pueden derivar…etc, pero igual no acabo con el artículo y creo que la base sí que la he plasmado.

Una cosa es clara: sin la propia evolución en los conocimientos sobre el ADN y su comportamiento no se podría haber llegado a la situación de Mullis. Personas como James D. Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin, Arthur Kornberg, H. Gobind Khorana o Thomas D. Brock tienen en sus espaldas haber sembrado poco a poco la información que ayudó a Kary B. Mullis a desarrollar su idea (que puede tener cierta controversia con el trabajo presentado por Kjell Kleppe).

Información adicional sobre la amplificación del ADN por PCR

Lo mejor es partir del propio escrito original de Kary B. Mullis. Después de generar las correspondientes patentes se puede encontrar por la red un par de documentos datados en 1986 y 1987 respectivamente con los títulos “Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction” y “Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction”.

Otra lectura que recomiendo encarecidamente es mi monográfico dedicado a la PCR que escribí en su momento para Journal of Feelsynapsis. Como la revista se ha reconvertido en Principia, cualquiera que desee leerlo puede pedirme una copia que se la enviaré con honores.

Este vídeo explica todo bastante bien con un inglés muy fácil de seguir. Incluso se observan los fragmentos que no son específicos (que no se buscan amplificar pero que se obtienen de todas formas por la hibridación de los primers)
[youtube]http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_KsDI[/youtube] Referencia del vídeo: Essential Cell Biology, 3rd Edition. Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, & Walter

Si se tuviera alguna duda al respecto, los comentarios e email están a disposición de cualquiera (y abiertos las 24 horas del día los 365 días del año).

Escuchando: el sonido de las campanas de Papá Noël…JOJOJO!!

El ADN

El ácido desoxirribonucléico ó ADN es una molécula de tipo polímero ya que está compuesta por una cadena de monómeros unidos entre sí. Cada monómero se llama nucleótido, que a su vez está constituído por tres componentes: una base nitrogenada, una pentosa (azúcar de cinco carbonos) y un fosfato.
La base del código genético la dictan las bases nitrogenadas. Son cuatro en el ADN Adenina y Guanina (A y G), que son bases púricas y Citosina y Timina (C y T), que son bases pirimidínicas. En el ARN la Timina deja lugar a la base llamada Uracilo (U). Por lo tanto existen cinco tipos de bases nitrogenadas. La combinación de las bases nitrogenadas provoca la generación del código genético. Por eso se pueden ver que las secuencias de ADN son del tipo “AACTGGGTCATGCGAA”.

A forma de repaso, quería recalcar que las bases nitrogenadas se unen a los azúcares (ribosas en el caso del ADN) y dan lugar a nucleósidos. Posteriormente, esos nucleósidos al unirse los fosfatos dan lugar a los nucleótidos. Era para recordar ese anuncio de una crema que anunciaba el descubrimiento de una molécula llamada Adenosina. Es para reirse. Que es la Adenosina más que el nucleósido que tiene la Adenina como base nitrogenada. Pero, qué se le va a hacer. Finalmente, el ADN (se puede extrapolar igualmente al ARN si se recuerda que las Timinas son Uracilos) no es más que la polimerización de nucleótidos que se unen mediante enlaces fosfato. A lo largo de la hebra van quedando los residuos de fosfato, con carga negativa, que confieren el carácter ácido a la molécula.
Hasta ahora se ha hablado de la formación de una hebra de ADN. Pero la forma básica de nuestro material hereditario no se encuentra un una sola hebra. Dos de estas hebras, que son complementarias por las uniones entre las bases púricas y las pirimidínicas (A con T y C con G), forman la doble hélice de ADN. Tiene un tamaño de 20 Armtrongs de diámetro y da una vuelta completa cada 34 Armstrongs.

Hay otras formas de hélice, pero esta es la forma natural y estable que se encuentra en la mayoría de las células. Posteriormente esta doble hélice sufrirá empaquetamientos sucesivos que daran lugar a su compresión y formación de los distintos cromosomas.
Bueno, espero que haya sido de utilidad. Si tenéis dudas, comentadlas e intentaré aclararlas todas.